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PCR实验室建设浅谈

来源:http://www.zzqchbgc.com/news/10.html发布时间:2016-12-21

                      PCR实验室建设浅谈

 

一、分子医学是新兴学科,它在分子水平上研究人类疾病的发生、发展、诊断和治疗,从本质上掌握疾病的规律极其根本性的防治策略。标准的分子生物学技术在遗传学诊断和新的治疗方法中也起着越来越大的作用。分子生物学方法是将自然发生的机制用于体外实验,例如转录和转化。大多分子生物学技术基于两个基本原理:    核酸修饰酶的应用;   核酸两条互补链之间的杂交(碱基配对)

 

聚合酶链式反应(PCR

是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物,在体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用热稳定的聚合酶,通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环,感兴趣的DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始,可产生ug量的PCR产物。PCR产物经克隆人载体、标记为一种探针而被进一步修饰,或直接测序。该技术以非常微量的模板开始,给予高的产率,产物并能以多种途径得以修饰。

 

PCR20世纪80年代后期世界上发展起来的一种DNA快速扩增技术,是基因检测的一种手段,具有高度敏感性、特异性、快速、简便等特点。当某种病原微生物中的病毒极少时,传统的检测方法难以检出,但通过PCR技术可将DNA片断扩增到百万倍以上,从而提高疾病诊断的水平。如目前对艾滋病病毒、肝炎病毒等检测就是应用PCR技术。然而PCR技术的检测结果易受自身和外部等多方面因素的影响,所以实验室不经技术准入验收合格,PCR检测结果将会失真,不能做合法检测依据。

PCR临床基因扩增检验实验室也就是PCR实验室原则上分为四个单独的工作区域:试剂贮存和准备区;标本制备区;扩增反应混合物配制和扩增区;扩增产物分析区。 各工作区域必须有明确的标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用。 进入各工作区域必须严格按照单一方向进行,即试剂储存和准备区 ->标本制备区->扩增反应混合物配制和扩增区->扩增产物分析区。不同的工作区域使用不同的工作服。人流,物流,污物流,空气流,压差,照度,温湿度,风速,灭菌,标牌,标志,警示牌都有严格规定。

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PCR实验室:临床基因扩增检验实验室

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标准的三区分隔和气压调节:
  PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。每个独立实验区设置有缓冲区,   同时各区通过气压调节,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和   环境的污染。
• 紫外灯消毒:
  在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。在试剂准备区和标本制备区   还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。
• 排风管道系统:
  可打开缓冲区,缓冲区 PCR 扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上和各扇门上都安装有   风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。
• 电子连锁不锈钢传递窗:
  试剂和标本通过电子连锁不锈钢传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染。(人物分流)
• 安全密封:
  主体为彩钢板、铝合金型材和玻璃。采用铝合金圆角立柱支撑,扣件和粘接部位设计合理周到,结构     固,线条简明,美观大方,密封性好。

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PCR实验室的建立

   为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.

1、样品准备区:这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:

1)PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。

2)组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。

3)用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。

4)DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。

5)大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。

6)管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。

7)任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。

2、样品准备和RNA-PCR

  RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。

3、前PCR区

 必须有专门用于准备各种反应的区域,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。

4、PCR实验室试剂的操作

1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。

3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。

4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。

5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。

6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。

7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

5、在前PCR区建立PCR混合物

1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。

2)如果你的实验室使用多套引物,以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。

3)作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且,你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。

4)阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染,阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。

5)当做阳性对照时,有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。

6)由于必须有对照反应,对照模板的特点应该予以考虑。

6、控制污染的方法

已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG,这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线,这种方法不能完全消除污染问题,但可以将污染降低几个数量级。

7、PCR仪的位置

8、后PCR区

PCR完成以后,需要分析样品并解释数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的,决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。

P3实验室,全称叫"生物安全防护三级实验室"P是英文"protect"的简称。整个实验室完全密封,室内处于负压状态,从而使实验室内部的气体不会跑到外面而造成污染。
生物安全防护实验室是指实验室的结构和设施、安全操作规程、安全设备能够确保工作人员在处理含有致病微生物及其毒素时,不受实验对象侵染,周围环境不受污染。根据微生物及其毒素的危害程度不同,分为4级,一级最低,四级最高。
传染性非典型肺炎是一种严重的传染性疾病。为确保生物安全,防止实验人员感染和污染环境,从事传染性非典型肺炎病毒研究必须在P3实验室进行。P3实验室是我国最高级别的实验室

 

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